CHO细胞作为治疗性抗体表达的最主要宿主细胞系，目前70%以上的治疗性抗体都是由CHO细胞生产的。同样的以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术是当下对细胞基因组进行靶向改造的最简单最有效的方法。因此，通过基因编辑技术对CHO细胞进行工程改造应运而生。

01基因编辑简介

上世纪50年代沃森和克里克提出DNA双螺旋结构模型以来，分子生物学的快速发展，让我们对基因的了解从宏观推进到了分子层面。而以上世纪90年代锌指核酸酶（ZFN,Zinc finger nuclease)基因编辑技术的发明为起点，直到本世纪初TALEN（Transcription activator-like effector nucleases）以及CRISPR/Cas9等基因编辑技术的相继发明，则让我们人类得以窃取了一丝上帝造物的权柄。

目前的基因编辑技术分为两类：CRISPR/Cas9，以及其它。CRISPR/Cas9技术自诞生以来，以其无与伦比的简单，高效，快捷等特点，成为了当前最“炙手可热”的基因编辑工具。2020年的诺贝尔化学奖和NCBI上多达15000篇的相关论文已经说明了一切。鉴于该技术详尽的介绍在搜索引擎上随处可见，我无意在此多费笔墨，请读者们自行查阅。

典型的基因编辑工具都由两个功能域组成：一个由氨基酸（ZFN,TALEN）或RNA（CRISPR/Cas9）介导的可编码的序列特异性DNA结合模块，负责对靶序列的识别；一个具有DNA内切酶活性的可切割DNA双链的模块，导致DNA双链断裂（DNA double strand breaks, DSBs)。DSBs出现后，细胞自身的DNA修复机制启动，对断裂的双链进行同源（Homology directed repair, HDR)或非同源末端修复（Non-homologous end joining, NHEJ)。非同源末端修复极易出错，会带来碱基的缺失或插入，导致移码突变或者终止密码子出现，由此对基因功能造成破坏，达到基因敲除的目的。而转入带有DNA双链断裂两端同源臂的修复模板（Repair template），则可通过同源末端修复达到外源基因的定点插入。

02抗体的ADCC效应与岩藻糖修饰

抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity ）是指抗体的Fab段结合病毒感染的细胞或肿瘤细胞的抗原表位，其Fc段与杀伤细胞（NK细胞、巨噬细胞等）表面的Fc受体结合，介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞。抗体通常通过铰链区及CH2区域和Fcγ受体结合。CH2结构域的Asn-N297糖基化位点的糖型成分（如乙酰葡糖胺，甘露糖，岩藻糖和唾液酸等）决定CH2结构的稳定性及结合特性。有研究显示降低Asn 297的岩藻糖修饰比例可显著增加抗体对杀伤细胞上CD16（Fcγ受体IIIa）的亲和力，并最终增加ADCC效应。

通过在CHO细胞培养基中添加抗体岩藻糖基化通路上相关酶的抑制剂或者岩藻糖类似物（如2FF）能降低抗体的岩藻糖基化水平，但是对于不同的抗体分子，往往需要通过优化添加剂的添加时间以及添加浓度才能达到理想的岩藻糖基化水平，并且在细胞工艺放大过程中的稳定性也有待考察。此外这些添加剂往往价格高昂，会显著提升生产成本。

03基因编辑技术敲除CHO细胞fut8基因

如何才能快速稳定的生产低岩藻糖基化的抗体？我们通过查阅文献注意到抗体的岩藻糖基化是糖蛋白翻译后修饰的一个普遍过程，核心岩藻糖基化即向N-糖链的核心五糖结构(GlcNAc2Man3)还原端第一个N-乙酰葡糖胺上添加一个α-1,6连接的岩藻糖，而岩藻糖基转移酶Fut8，是唯一一个能催化形成α-1,6岩藻糖苷键的岩藻糖基转移酶。因此，如果能敲除CHO细胞基因组内表达该酶的基因，CHO细胞即可生产理论上无岩藻糖修饰的抗体。

据此，我们采用基因编辑技术，敲除了CHO-K1细胞基因组内的两个fut8等位基因。利用敲除fut8基因后的细胞进行瞬时转染表达，并评估抗体的表达量和岩藻糖基化水平。

从上述数据我们可以看出，野生型的CHO-K1细胞系通过平台工艺表达的抗体，岩藻糖基化水平在75%以上；通过2FF工艺，岩藻糖基化水平在15%以下；而fut8基因敲除的细胞系Fut8-KO-CHO-K1采用平台工艺表达的抗体其岩藻糖基化水平稳定保持在1.5%以下。从多个不同项目分子，我们可以发现无论是采用2FF工艺，还是用Fut8-KO-CHO-K1细胞，其表达量都明显低于采用平台工艺的CHO-K1细胞的表达量，推测是由于岩藻糖比例降低，影响了细胞内与抗体转录、翻译或者分泌相关的蛋白的活性，从而导致整体表达量降低。从mAb2，mAb3项目我们可以看到，Fut8-KO-CHO-K1细胞的表达水平不低于采用2FF工艺的野生型CHO-K1细胞的表达水平，这可以证明fut8基因的缺失，并未从其它方面影响CHO细胞的生理活动。

04结语

当前，工业界仍习惯于通过随机整合的方式来构建稳转细胞株，通过培养工艺优化的方式来提高抗体的表达量和质量，然而，随着基因编辑技术的不断完善和发展，其操作越来越简单、高效。通过外源基因定点插入转录热点区域来构建稳转细胞株，或者通过基因编辑技术来敲入或敲除抗体转录、翻译、翻译后修饰、分泌等相关的基因来调节抗体的表达量和质量，这些方法的开发和研究正在如火如荼的进行，想必不久的将来会在工业界得到良好的应用。本文通过基因编辑技术构建了一个能表达低岩藻糖修饰水平蛋白的CHO细胞系，就提供了一个很好的例子。

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